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I tubi si mettono a 37°C per 15 minuti per favorire in processo. Successivamente i campioni vengono ripresi e continua la fase di blocco. Si prepara il prefissativo (costituito da metanolo: acido acetico in rapporto 3 a 5) si aggiunge per rendere le cellule, molto fragili in questo momento, più resistenti alle successive centrifugazioni, aggregandole. A questo stadio le cellule sono ancora vive. Dal momento in cui si utilizza il prefissativo, contenente il metanolo e l’acido acetico, occorre lavorare sotto cappa chimica, detta anche cappa d’aspirazione Le cappe chimiche sono i principali dispositivi di protezione collettiva per la tutela della salute degli operatori dal rischio derivante dall’uso e dalla manipolazione di agenti chimici pericolosi. Ed hanno lo scopo di ridurre la concentrazione ambientale di polveri, fumi, gas e vapori di sostanze tossiche che si possono generare durante le attività svolte nei laboratori scientifici di ricerca e didattica L’efficienza della cappa chimica deve essere verificata sia al momento della prima installazione sia nel corso del tempo con controlli periodici. La cappa chimica è caratterizzata da un sistema di aspirazione che, aspirando aria dall’ambiente attraverso l’apertura di lavoro frontale, determina un flusso d’aria innescato e mantenuto da un elettro-aspiratore, essa entra nella camera di lavoro delimitata dallo schermo e dal piano di lavoro. La velocità frontale dell’aria aspirata non deve essere inferiore a zero virgola cinque metri al secondo; tali valori sono da intendersi riferiti a 40 centimetri di apertura del frontale e sono da controllare con cadenza annuale. Quando il prefissativo viene aggiunto alle cellule in ipotonica si osserva un cambiamento di colore dal rosso al marrone perché i globuli rossi che scoppiano liberano il ferro contenuto nell’ EME ed esso si ossida. Si risospende bene con una pasteur di plastica. Si fa una nuova centrifuga sempre a 2100 ripetizioni per minuto per 5 minuti. Al termine è allontanato il surnatante ed il pellet è ben risospeso. Ora si aggiunge il metanolo che da inizio alla prima fissazione e disidratazione delle cellule. Lo scopo della fissazione è quello di preservare le strutture delle cellule nel loro stato morfologico, bloccando la loro degradazione, dopo il blocco ed in seguito alla variazione di temperatura e di pH. La fissazione deve preservare i campioni dall'attacco di muffe e batteri e conservare al meglio la morfologia strutturale ed ultrastrutturale del tessuto e della cellula ed anche consentire al preparato di sopportare gli stress fisici e chimici delle successive fasi di allestimento del preparato. In generale può durare da pochi minuti fino a 24 - 48 ore. Le cellule in metanolo vengono risospese bene ed i tubi si mettono a -20°C per almeno 30 minuti. Dopo almeno una mezz’ora in congelatore le cellule in metanolo vengono nuovamente centrifugate a 2100 rpm ripetizioni per minuto per 5 minuti Al termine il surnatante costituito da metanolo è allontanato. E si procede con la fissazione vera e propria. Il pellet viene ben risospeso. Si procede alla preparazione del fissativo. Come fissativo nella preparazione delle piastre metafasiche è utilizzata la miscela di Carnoy (costituita da metanolo: acido acetico in rapporto 3:1). Questa miscela blocca le funzioni cellulari e previene l’ulteriore ingrossamento delle cellule, stabilizza la struttura dei cromosomi, altrimenti fragili, rimuove le proteine, conserva la morfologia cellulare, disidrata il preparato rendendolo più duraturo, ritardando l’azione degli agenti ossidanti (metanolo). Il citoplasma, in cui sono immersi i cromosomi, risulta disidratato dall’alcool e ridotto dall’acido acetico. Occorre tener presente che se l'acido acetico non funziona bene a causa dell'umidità dell'aria o perchè aperto da troppo tempo, la sua azione disgregante non si esplica. Ciò fa sì che i preparati rimangono sempre con la matrice citosol-nucleare, e i cromosomi risultano ancora troppo condensati e piccoli e quindi difficili da vedere al microscopio. I fissativi chimici si dividono in: - I fissativi primari coagulanti che rappresentano una classe di molecole capaci di attraversare la membrana cellulare, all'interno della cellula determinano la denaturazione delle proteine, con un effetto coagulante. Tra i principali troviamo l’alcool (etanolo e metanolo). I fissativi primari non coagulanti che bloccano l'attività delle proteine senza causarne la precipitazione. Tra i principali troviamo l’acido acetico. Si fa una nuova centrifuga sempre a 2100 ripetizioni per minuto per 5 minuti. Avviando la centrifuga, la crociera ruoterà sul proprio asse di simmetria e se all’interno delle provette si trova una soluzione eterogenea, l’azione della forza centrifuga spingerà il solido verso il fondo della provetta, separando la fase solida da quella liquida.