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Per coltura, in vitro, s’intende l’applicazione biotecnologica in cui le cellule sono coltivate in un ambiente sterile ed artificiale ed in condizioni chimico-fisiche controllate. Per preparare il terreno di coltura completo per allestire le colture cellulari di sangue periferico si utilizzano di Terreno RPMI, il 10% di siero fetale bovino, l’1,5% di fitoemoagglutinina e l' 1% di antibiotici. I terreni sono fondamentalmente formati da una soluzione isotonica e tamponata che contiene sali inorganici, una fonte energetica come ad esempio il glucosio, gli aminoacidi essenziali. Noi utilizziamo il terreno utilizzato è l’RPMI 1640 con Gluta-MAX, dipeptide L-alanina-L-glutammina ed HEPES, una sostanza organica utilizzata che mantenere stabile il pH fisiologico, tra pH 7.2 e pH 7.6 ed il rosso fenolo, indicatore di pH. Si aggiunge poi il SIERO bovino fetale al 10%, esso è una miscela complessa che contiene: Fattori ormonali, che stimolano la crescita, la proliferazione cellulare ed il differenziamento. Proteine di trasporto, fattori di adesione cellulare, stabilizzanti e disintossicanti, viene inattivato al calore in bagnetto termostatato a 56°C per 30 minuti al fine di distruggere le molecole del complemento le immunoglobuline. La cascata di reazione del complemento porta alla lisi cellulare, e quindi alla morte della coltura. Con la pipetta, che è un altro sistema per trasferire liquidi da un recipiente ad un altro si aggiunge FITOEMOAGGLUTININA che è una lectina estratta dal fagiolo. La fito ha due diversi tipi di subunità: L, responsabile delle proprietà mitogene, reattive con i linfociti ed E capace di agglutinare gli eritrociti. Infine, si aggiungono gli ANTIBIOTICI, quelli utilizzati routinariamente, sono: penicillina, streptomicina. Antibiotici ad ampio spettro. Aggiunti tutti i componenti per ottenere il terreno completo si dispensano 4,7 ml in ogni tubo sterile da coltura e si aggiungono 300 microlitri di sangue intero. Si spegne la cappa, si chiude e si esegue un ciclo di radiazioni UV a 260 nanometri per almeno 1 ora. Le provette si mettono in un incubatore termostatato a 37°C, perché le nostre sono cellule umane. Le cellule possono sopravvivere a lievi ipotermie rispetto alla temperatura ottimale, ma lievi ipertermie portano a morte o alterazioni. I tubi si collocano su una piastra girevole per mimare il flusso sanguigno. Alla settantesima ora si aggiungono 50 microlitri di COLCEMID, alcaloide sintetico derivato della colchicina, estratta dal Colchico d'autunno. Esso viene utilizzato per arrestare le cellule in metafase. Previene la formazione del fuso durante la mitosi, depolimerizzando i microtubuli, causando così l’arresto in meta-fase. Si continua a lavorare sotto cappa biologica per non contaminare le colture, in questo momento le cellule sono ancora vive. La soluzione ipotonica di KCl zero virgola zero settantacinque Molare da utilizzare nella fase di raccolta viene preparata pesando due virgola otto grammi di KCl a cui sono aggiunti 500 ml di acqua deionizzata. Essa è posta poi a 37°C per evitare uno shock termico alle cellule quando essa verrà aggiunta. Successivamente si procede al blocco della coltura, le cellule, dopo la messa in coltura di 72 ore, sono raccolte mediante centrifugazione (e scarto del surnatante). La centrifuga da laboratorio è uno strumento che viene usato per separare due corpi con diversa densità attraverso l’impiego dell’accelerazione centrifuga. Tale processo è detto centrifugazione ed è basato sul fenomeno della sedimentazione di un corpo solido ad alta densità miscelato ad un fluido a densità più bassa. La centrifugazione aumenta l’accelerazione gravitazionale applicata alla sospensione presa in esame sostituendola con la forza centrifuga, cioè una forza specifica che agisce su un corpo che si muove con moto circolare. Bisogna sempre “bilanciare le provette”, cioè il peso di due campioni in posizione diametralmente opposta deve essere identico. Infine, la centrifuga si setta a 2100 ripetizioni per minuti per 5 minuti e si fa partire. Terminata la centrifugazione occorre sfilare le provette con delicatezza dagli alloggi per evitare di mescolare nuovamente la miscela appena separata. Il surnatante è eliminato con un aspiratore automatico sottovuoto o anche con una pipetta pasteur di plastica dotata di una tettarella. Il pellet viene ben risospeso e successivamente si aggiunge la soluzione ipotonica goccia a goccia, risospendendo continuamente per evitare che i globuli rossi si agglutinano intrappolando i linfociti. La soluzione ipotonica si utilizza per creare un ambiente ad una concentrazione salina minore rispetto a quella citoplasmatica che permette all’acqua di entrare nelle cellule secondo un gradiente di concentrazione, i globuli rossi scoppiano, i linfociti si rigonfiano ed i cromosomi all’interno della membrana citoplasmatica molto stirata ed assottigliata risultano sospesi.